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2021-03-02 03:55 来源：维基百科

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青林ip1nv1n302 / 科研 / 我是如何做可变剪切

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我是如何做可变剪切

2021-03-02  青林ip1nv...

我是如何做可变剪切

    理论篇

        一、什么是可变剪切

        二、可变剪切的类型

    分析篇

        一、搜官网

        二、逐个拆解


当需要分析一个新的测序数据或者对一种数据做新的分析的时候（按我一脸懵逼的心情，我给它取了一个名字，“de novo'分析），网上教程很多，也有很多软件，我选择了SGSeq。

理论篇

一、什么是可变剪切

可变剪切又叫选择性剪切（Alternative splicing, AS），生物的基因序列包含了外显子（exon）和内含子（intron），两者相互间隔。在mRNA前体的剪接过程中，参加剪接的外显子可以不按其线性次序剪接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟mRNA中是可以选择的，这种剪接方式称为选择性剪接。AS也是转录本复杂性的一个主要来源。

二、可变剪切的类型

关于可变剪切的类型，有几种不同的说法，但都主要包含下面五种：

http://www.cnblogs.com.comlgnw.cn/daimakun/p/5079689.html

1、外显子跳跃（Exon Skipping）

2、内含子保留（Intron Retention）

3、5'端可变剪接（Alternative 5' splice Site）

4、3'端可变剪接（Alternative 3' splice Site）

5、最后一个外显子可变剪接（Alternative Last Exon）

6、第一个外显子可变剪接（Alternative First Exon）

最后两个（5、6）可以概括为可变外显子（Alternative Exon），这张图的好处就是有表达量，可以很清晰地看出到底哪些地方转录了，哪些地方没有转录。

还不过瘾？那看看这个详细的介绍吧：http://mp.weixin.qq.com.comlgnw.cn/s/2EC2NRPNxj_ZeNWv7qCb_w


分析篇

一、搜官网

首先到bioconductor里面找到这个包，传送门https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/SGSeq.html

这里告诉了我们SGSeq是用来分析可变剪切的R package，输入是RNA-seq比对后的BAM file，下面是安装方法，以及PDF/HTML两种格式的manual和一个版本更新信息。点开HTML/PDF其中的一种，即可看到详细的用法，共14个版块。

二、逐个拆解

①转录本的特征和可变剪切事件，SGSeq分析步骤

②下载调用SGSeq

  1. source('https://bioconductor.org/biocLite.R')

  2. biocLite('SGSeq')

  3. library(SGSeq)

  4. si   #SGSeq中的测试数据

  5. path <> system.file('extdata', package = 'SGSeq')

  6. si$file_bam <> file.path(path, 'bams', si$file_bam)   #添加路径

  7. si   #和前面的si不一样

③注释信息：TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene


  1. biocLite('TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene')

  2. library(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)

  3. txdb <> TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene

  4. txdb <> keepSeqlevels(txdb, 'chr16')

  5. seqlevelsStyle(txdb) <> 'NCBI'

用convertToTxFeatures函数转换类型对象

  1. txf_ucsc <> convertToTxFeatures(txdb)

  2. txf_ucsc <> txf_ucsc[txf_ucsc %over% gr]

  3. head(txf_ucsc)

这里每个字母代表的剪切类型

  • J (splice junction)

  • I (internal exon)

  • F (first/5′′-terminal exon)

  • L (last/5′′-terminal exon)

  • U (unspliced transcript)

④再次转换

  1. sgf_ucsc <> convertToSGFeatures(txf_ucsc)

  2. head(sgf_ucsc)

字母代表的含义

  • J (splice junction)

  • E (disjoint exon bin)

  • D (splice donor site)

  • A (splice acceptor site

⑤根据注释的转录本信息转换成剪切信息

  1. sgfc_ucsc <> analyzeFeatures(si, features = txf_ucsc)

  2. sgfc_ucsc

  3. colData(sgfc_ucsc)

  4. rowRanges(sgfc_ucsc)

  5. head(counts(sgfc_ucsc))

  6. head(FPKM(sgfc_ucsc))

  7. df <> plotFeatures(sgfc_ucsc, geneID = 1)

历经千辛万苦，终于出来一张图！每一行表示一个bam file，每一列表示外显子的表达，表达程度用染色表示。

⑥用从RNAseq数据中预测的信息作注释，instead of relying on existing anntation

  1. sgfc_pred <> analyzeFeatures(si, which = gr)

  2. head(rowRanges(sgfc_pred))

  3. sgfc_pred <> annotate(sgfc_pred, txf_ucsc)

  4. head(rowRanges(sgfc_pred))

  5. df <> plotFeatures(sgfc_pred, geneID = 1, color_novel = 'red')

将可变剪切的外显子高亮

最后一部分，可视化

  1. plotFeatures(sgfc_pred, geneID = 1)

  2. plotFeatures(sgfc_pred, geneName = '79791')

  3. plotFeatures(sgfc_pred, which = gr)

  4. plotFeatures(sgfc_pred, geneID = 1, include = 'junctions')

  5. plotFeatures(sgfc_pred, geneID = 1, include = 'exons')

  6. plotFeatures(sgfc_pred, geneID = 1, include = 'both')

  7. plotFeatures(sgfc_pred, geneID = 1, toscale = 'gene')

  8. plotFeatures(sgfc_pred, geneID = 1, toscale = 'exon')

  9. plotFeatures(sgfc_pred, geneID = 1, toscale = 'none')

  10. par(mfrow = c(5, 1), mar = c(1, 3, 1, 1))

  11. plotSpliceGraph(rowRanges(sgfc_pred), geneID = 1, toscale = 'none', color_novel = 'red')

  12. for (j in 1:4) {

  13.  plotCoverage(sgfc_pred[, j], geneID = 1, toscale = 'none')

  14. }


这里使用的都是SGSeq的测试数据，那我们自产自销的数据呢，只需要修改一下si即可，例：

  1. si =read.table('~/data/project/scRNA/bam/tumor/SC1/config',stringsAsFactors = F)

  2. head(si)

  3. si <> data.frame('sample_name' = si$V1,

  4.                 'file_bam'=  si$V2,

  5.                 'paired_end'=TRUE ,

  6.                 'read_length' = 50,

  7.                 'frag_length' =300,

  8.                 'lib_size'= si$V3,stringsAsFactors = F

  9. )

  10. rownames(si)=si$sample_name

  11. str(si)

快去试试吧


参考资料：

https://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/SGSeq/inst/doc/SGSeq.html

http://mp.weixin.qq.com.comlgnw.cn/s/XZX5pGapOMQ7EXMiJVHE4w

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